单病毒跟踪(Single-virus tracking， SVT)为实时监测单个病毒的传播过程提供了机会，并可探索活细胞中病毒与细胞结构之间的相互作用，有助于描述复杂的感染过程并揭示相关的动态机制。然而，传统荧光标记(如有机染料和荧光蛋白)的低亮度和光稳定性差极大地限制了SVT技术的发展，在长时间内进行多色SVT仍存在挑战。
由于量子点(quantum dots, QDs)具有出色的光稳定性、高亮度和可调颜色范围的窄发射，基于QD的SVT (QD-based SVT, QSVT)使我们能够在单个病毒水平上跟踪单个病毒与不同细胞结构相互作用的命运，时间从毫秒到小时不等，提供关于活细胞中病毒感染的更准确和详细的信息。到目前为止，QSVT技术在揭示病毒进入、贩运和出口的相关机制方面取得了惊人的成就。
2022年11月30日，南开大学庞代文团队在Nature Protocols 杂志在线发表题为“Single-virus tracking with quantum dots in live cells”的研究论文，该研究以之前系统研究过的病毒为例，提供了QSVT实现的详细操作流程。描述了在活细胞中进行QSVT实验的具体步骤，包括病毒制备、QD标记策略、成像方法、图像处理和数据分析。该实验流程从病毒和细胞标本的制备到图像采集需要1 - 2周，图像处理和数据分析需要1 天。
病毒是一种寄生在细胞内，并通过劫持宿主细胞的新陈代谢过程来完成自身生命活动的微生物。病毒感染始于病毒与细胞表面的特定受体结合。一些病毒通过与膜受体和脂质微环境的相互作用与质膜融合，将其基因组释放到宿主细胞中。其他病毒通过内吞作用进入宿主细胞，然后被隔离在特定的细胞器中，在适当的条件下释放其基因组到目标位点进行复制。经过一段时间的积累，新合成的病毒蛋白和病毒基因组被包装成感染性子代，通过细胞裂解和胞外分泌离开细胞。
因此，病毒在宿主细胞中的传播过程是一个复杂而动态的过程，包括多种感染途径和步骤、病毒成分的分离以及与细胞结构的复杂相互作用。全面了解病毒感染所涉及的动力学和机制，可能有助于病毒性疾病的预防和治疗以及抗病毒药物的开发。
基于量子点(QD)的单病毒跟踪(QSVT)技术是一种利用量子点作为荧光标记来标记不同病毒成分的成像方法，利用荧光显微镜来研究单个病毒的感染过程以及病毒与细胞成分之间的动态关系。在QSVT实验中，单个病毒或带有QD标记的病毒成分的行为可以在宿主细胞内长期实时监测。通过重构单个病毒的运动轨迹，可以细致地提取相关的动态信息，揭示病毒的感染机制。量子点极高的亮度和极佳的光稳定性促进了单个病毒的高对比度和长时间跨度成像，从毫秒到小时不等，并允许以纳米级的精度定位单个病毒。量子点的颜色可调发射具有较窄的半最大宽度，是同步多组分病毒标记的优良标记，具有单病毒敏感性。因此，量子点极大地促进了单病毒跟踪(SVT)技术的发展，特别是在需要长期和多色成像的病毒旅行和单病毒水平的病毒-细胞相互作用研究等应用领域。
该操作流程用来说明QSVT如何可以很容易地用于破译病毒的复杂感染过程和揭示潜在的机制，流程共分为六个阶段：
第1阶段:病毒扩增和表征。首先对病毒库进行扩增和纯化，以获得符合高效标记病毒要求的样本，以避免成像过程中非病毒结构的干扰。
第2阶段:细胞标记和药物抑制。细胞需要在玻璃底的培养皿中进行共聚焦成像。
第3阶段:用量子点标记病毒。在病毒感染活细胞的过程中，随着感染过程的推进，病毒的不同组分会被动态拆卸，因此需要分别或同时对病毒的内外组分进行QD标记，以全面了解病毒感染的机制。
第4阶段:图像采集。单个病毒在活细胞中的感染行为可以用配备有足够灵敏度和快速捕获能力的探测器的荧光显微镜进行监测。
第5阶段:图像处理。在获得含有大量信息的显微镜图像后，需要通过图像处理步骤，包括降噪、粒子定位和轨迹重建，获得病毒感染行为的轨迹。
第6阶段:数据分析。最后，通过对病毒运动轨迹的分析，包括传输特性分析、荧光强度分析和多色图像分析，提取与病毒感染相关的动态参数，揭示病毒感染的潜在机制。
图1. QSVT的流程图（图源自Nature Protocols ）
病毒感染是一个复杂的过程，病毒与宿主细胞在时空上动态相互作用。QSVT技术有助于深入研究各种动物病毒在宿主细胞中的转运行为和潜在的感染途径机制。通过补充细胞标记技术和药物抑制试验，该技术可以广泛获取与病毒相关的细胞成分的动态信息，以揭示其潜在的生物机制。
图2. 病毒在宿主细胞中的运输过程（图源自Nature Protocols ）
总的来说，该技术适用于需要研究病毒感染动态机制的广泛情况。例如，新兴病毒的动态感染机制迫切需要该技术，目前开发的策略和工具可能推动病毒预防和病毒疫苗开发领域的发展。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41596-022-00775-7